酵母双杂交（生物术语）

酵母双杂交

生物术语

酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。

酵母双杂交系统(yeasttwo-hybridsystem)是一种直接于酵母细胞内检测蛋白质-蛋白质相互作用而且灵敏度很高的分子生物学方法。该系统在1989年有Fields和Song等在研究真核基因转录调控中首次建立并得到广泛的应用。此项技术的出现使以往因耗时、繁琐的物理测定和基因筛选限制而无法实现的许多设想，都可能逐一实现，酵母双杂交系统是鉴定及分析蛋白质-蛋白质间相互作用的最常用及最有效的工具之一，此技术现已逐渐推广到了如信号传导、细胞周期调控及基因表达调控等多个领域。

基本思想

酵母双杂交由Fields在1989年提出。他的产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究。GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域。位于N端1-147位氨基酸残基区段的DNA结合域（DNAbindingdomain，DNA-BD）和位于C端768-881位氨基酸残基区段的转录激活域（Activationdomain,AD)。

DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因（GAL4responsivegene）的上游激活序列(Upstreamactivatingsequence,UAS)，并与之结合。而AD则是通过与转录机构（transcriptionmachinery）中的其他成分之间的结合作用，以启动UAS下游的基因进行转录。DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子，使启动子下游基因得到转录。

Fields建立了一个双杂交系统，BD与X蛋白融合，AD与Y蛋白融合，如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物，使GAL4两个结构域重新构成，则会启动特异基因序列的转录。他们利用Snf1与Snf4的相互作用，将Snf1与BD融合，Snf4与AD融合，构建在穿梭质粒上。其中Snf1是一种依赖于丝氨酸、苏氨酸的蛋白激酶，Snf4是他的一个结合蛋白。

研究者将二种穿梭质粒转化酵母GGY：171菌株，该菌株含有LacZ报告基因，并已去除相应转录因子基因。该实验的结果表明由Snf1和Snf4相互作用使得AD和BD在空间上接近，激活了报告基因LacZ的转录。一般地，将BD-X的融合蛋白称作诱饵（bait),X往往是已知蛋白，AD-Y称作猎物（prey），能显示诱饵和猎物相互作用的基因称报告基因，通过对报告基因的检测，反过来可判断诱饵和猎物之间是否存在相互作用。

基本原理

双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明，转录激活因子在结构上是组件式的（modular）,即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA结合结构域（DNAbindingdomain，简称为BD）和转录激活结构域（activationdomain，简称为AD），它们是转录激活因子发挥功能所必需的。

前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。

两个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。

单独的BD虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。而不同转录激活因子的BD和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的BD与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。

主要有二类载体：a含DNA-bindingdomain的载体；b含DNA-activatingdomain的载体。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd）；另一个蛋白的基因融合到转录激活结构域（如GAL4-ad，VP16）。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。

融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列（nuclear-localizationsequence），而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有：GAL4（1-147）;LexA(Ecoli转录抑制因子）的DNA-bd编码序列。常用的activating-domain基因有：GAL4（768-881）和疱疹病毒VP16的编码序列等。

双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因（reportergene）的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点：

〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达（如lacZ），从而可分析蛋白间的结合作用。

酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。

主要是由于：

①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。

文库筛选

将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构建诱饵质粒；将诱饵质粒转化缺

乏报告基因启动子的酵母细胞株中，选择被转化的酵母；再将文库质粒转化到酵母中。

通过报告基因的功能筛选相互作用的蛋白，从酵母中分离质粒然后转化E。coli，从大肠杆菌中提取质粒并测序，在数据库中比对所测定序列与已知蛋白的同源性。

结构组成

酵母双杂交系统可应用于确定两已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构域。

利用此系统已分析和测定了多种重要结构域，如p85三磷酸肌醇激酶和p110亚单位作用的结构域v，p21cip1蛋白与增殖细胞核抗原(proliferating-cellnuclearantigen,PCNA)的结合序列等。

此外酵母双杂交系统还应用于阐明蛋白质相互作用的结构域，绘制蛋白质联系图谱，在药物设计等许多方面。

相关应用

酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。

大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。

发现新的蛋白质和蛋白质的新功能

酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。

另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。例如：Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交CLONTECHMATCHMARKERSYSTEM3为操作平台，从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并证明了Synphilin-1与alpha-synuclein之间的相互作用与帕金森病的发病有密切相关。

为了研究两个蛋白之间的相互作用的结合位点，找到影响或抑制两个蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1-65个氨基酸残基和Synphilin-1的349-555个氨基酸残基之间是相互作用的位点。研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。

在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用

利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。

而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。例如：来源于矮牵牛的黄烷酮醇还原酶DFR与其抗体scFv的反应中，抗体的单链的三个可变区A4、G4、H3与抗原之间作用有强弱的差异。

Geert等利用酵母双杂交技术，将DFR作为诱饵蛋白，编码抗体的三个可变区的基因分别被克隆在AD-LIBRARY载体上，将BD-BAIT载体和每种AD-LIBRARY载体分别转化改造后的酵母菌株中，并检测报告基因在克隆的菌落中的表达活性，从而在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。

筛选药物作用位点及药物对蛋白相互作用影响

酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。

例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin的相互作用有关。

研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。

建立基因组蛋白连锁图

众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。

对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。

系统方法及其优化

在双杂交鉴定过程中要经过两次转化，这个工作量是相当大的，特别是寻找新的作用蛋白质的时候尤其如此。而且，酵母细胞的转化效率比细菌要低约4个数量级。

因此转化步骤就成为双杂交技术的瓶颈。Bendixen等人通过酵母接合型的引用，避免了两次转化操作，同时又提高了双杂交的效率。在酵母的有性生殖过程中涉及到两种配合类型：a接合型和α接合型，这两种单倍体之间接合（mating）能形成二倍体，但a接合型细胞之间或α接合型细胞之间不能接合形成二倍体。

根据酵母有性生殖的这一特点，他们将文库质粒转化α接合型酵母细胞，“诱饵”表达载体转化a接合型细胞。然后分别铺筛选平板使细胞长成菌苔（lawn），再将两种菌苔复印到同一个三重筛选平板上，原则上只有诱饵和靶蛋白发生了相互作用的二倍体细胞才能在此平板上生长。

单倍体细胞或虽然是二倍体细胞但DB融合蛋白和AD融合蛋白不相互作用的都被淘汰。长出来的克隆进一步通过β-半乳糖苷酶活力进行鉴定。这项改进不仅简化了实验操作，而且也提高了双杂交的筛选效率。

Vidal等人发展了所谓的逆双杂交系统（reversetwo-hybridsystem）。这项技术的关键是报道基因URA3的引入。URA3基因在这里起到了反选择的作用,它编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。

该酶能把5-氟乳清酸(5-FOA)转化成对细胞有毒的物质。

Vidal等人通过改造在URA3基因的启动子内引入Gal4的结合位点。这个改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上只有当“诱饵”和“猎物”相互作用激活URA3基因的表达才能生长。

在含有5-FOA的完全培养基上“诱饵”和“猎物”的相互作用则抑制细胞的生长。然而如果目的蛋白，即与DB或AD融合的蛋白质发生了突变或者由于外加药物的干扰不再相互作用，URA3基因不表达，则细胞能在含有5-FOA的完全培养基上生长。

通过这种方法，Vidal等人筛选到了转录因子E2F1的突变物，这些突变物仍然能结合视网膜母细胞瘤蛋白RB，但是丧失了同另外一种称为DP1蛋白的结合能力。

结果得到了体外结合实验的验证。通过对这些突变蛋白基因的测序，他们发现了新的E2F1同DP1结合的位点。

在某些情况下，在液体培养基中培养不好的菌珠可以在固体培养基上生长得很好。如果诱饵蛋白对酵母细胞是有毒的，可以通过基因重组切掉转录激活域，然后重新检测其是否自激活，但要注意重组也有可能破坏蛋白之间的互作。

一个甚至两个融合蛋白对酵母细胞有毒。你可以通过重组方法来减轻毒性，同时又能保证蛋白的相互作用。或者使用表达水平较低的载体。也可以在琼脂平板或滤膜上进行杂交。

但同时必须作杂交对照实验。酵母双杂交实验转化效率太低，可以采用以下方法解决：

1)检测一下DNA的纯度，如果可以的话，重新用乙醇纯化。

2)DNA-BD/诱饵蛋白很可能是有毒的。

3)不适当的培养基，重新配制培养基，并做对照转化。

4)检测pGBT9对照载体的转化效率，放置于SD/–Trp平板上，转化效率应该在1x105colonies/mgDNA以上。

在杂交中，预转化的诱饵细胞的数量可能不够，杂交效率不高。

当对诱饵菌株进行液体培养过夜时，应挑选大的、新鲜的克隆进行培养，经过离心和重悬后，再使用血球计对细胞进行计数。

改进版本

反式转录因子抑制（RTA）系统与经典的Y2H相反，诱饵-猎物的互作将抑制转录因子激活报告基因。诱饵蛋白X与Gal4的DBD融合后具有转录因子的激活活性，另一个蛋白Y与一种转录阻碍物（Tup1p）的抑制结构域（RD）融合。

如果两者可以相互作用，报告基因的转录就会被抑制。RTA系统已被用于研究哺乳动物basichelix-loop-helixproteinsMyoD和E12、protooncogenictranscriptionfactorc-Myc与theputativetumorsuppressorproteinBin1蛋白间的相互作用。

同时，该系统还被用于筛选与各种转录激活因子的相互作用，如单纯性疱疹病毒（HSV-1）调控蛋白VP16，c-Myc及雄性激素受体。

SOS和RAS募集系统(SRSandRRS)是Ras信号通路转录的旁路（arebypassingthetranscriptionalreadoutbyusingtheRassignallingpathway），在酵母细胞和哺乳动物中是相似的。

Ras被定位在质膜上，可通过酵母中的Cdc25或哺乳动物中的Sonofsevenless(SOS)脒基交换因子进行GDP-GTP的转换。Ras被激活后会引发下游信号转导途径。

此处描述的Y2H系统使用Cdc25-2温度敏感型酵母菌株，因为Cdc25-2没有活性，不能激活Ras信号转导途径，导致此菌株在高温（36℃）下不能生长。通过Y2H系统中选择性激活Ras，可以使其温度敏感表型消失。

SCINEX-P系统（胞外蛋白间的互作筛选）由Urech等于2003年发布，使我们可以分析ER内的氧化环境中的蛋白互作。该系统利用酵母未折叠蛋白反应（UPR）的信号途径。

ER中错误折叠蛋白的积累会诱导酵母ERI类跨膜蛋白（Ire1p）形成二聚体，后者诱导Hac1p转录，其产物可激活分子伴侣的转录。

在SCINEX-P系统中，目的蛋白与缺少位于腔内的N末端寡聚化结构域的Ire1p突变蛋白（ΔIre1p）融合。两种杂合蛋白的互作会引起Ire1p蛋白二聚体的重构，从而激活UPR下游信号转导过程。

为了检测蛋白互作，Hac1pUPR元件被引入报告基因的启动子上。此Y2H系统被成功地用于分析蛋白质二硫键异构酶ERp57与钙联蛋白间（这两个蛋白都在ER中折叠）、抗原与抗体间的互作。

由Johnsson和Varshavsky于1994年设计，可用于测定细胞质基质蛋白间的互作检测；后来又被扩展为膜蛋白间的互作筛选。泛素是一类小蛋白，对于细胞中错误折叠的蛋白是十分重要的。

蛋白通过与一个多聚泛素蛋白链共价结合被标记为蛋白酶体的降解对象。该链将被泛素特异性蛋白酶（USP）首先从蛋白上降解。分裂泛素化Y2H技术基于泛素可分裂为两个独立的片段。

已有的研究显示泛素可分裂为N端（Nub）及C端（Cub），并且这个片段间有亲和性，可能自发形成与原泛素类似的蛋白。通过在Nub（NubG,NubA）的点突变（I13GorI13A）可使Nub和Cub的自发组装无法进行。

在这两种突变体中，只有两部分由于NubG/A和Cub互作而被拉到足够接近的距离时，才能发生有效地结合。重构的分裂化泛素可被USPs识别，然后切掉与CubC端融合的报告蛋白。

最初的系统使用二氢叶酸还原酶作为报告基因，后者产物可通过SDS-PAGE检测。然而，由于需要使用免疫共沉淀和电泳分离，阳性克隆的鉴定十分不便。

(MbY2H)系统使用人工转录因子（LexA-VP16）作为与泛素相连可被水解的报告蛋白，可分析ER膜蛋白间的相互作用。一旦泛素被重组，LexA-VP16就被释放到核中并激活报告基因的转录（如HIS3，LacZ）。

这种转录激活方式放大了蛋白的互作反应，对瞬时互作的检更敏感、更方便。此系统已被成功用于检测不同种类膜蛋白间的互作反应。分裂泛素系统已被广泛应用于cDNA文库筛选和大规模矩阵法中。

近期，改进后适用于胞质蛋白互作筛选的MbY2H系统已被发布。在此改进方案中，诱饵载体上包括Cub和转录因子，并且由于融合了ER膜蛋白Ost4p，使此融合蛋白锚定在ER膜上。

发展前景

在后基因组时代更具意义且更能发挥酵母双杂交技术的领域是研究生命活动中的网络调节。第一个具有开拓性的工作是Bartel利用酵母双杂交技术建立了一个T7-噬菌体的网络调节图（linkage-map）。

Fromont-Racine等对筛选到的阳性克隆进行鉴定测序，并将它们分为5类，然后对其中的四类（非编码序列除外）通过15轮的筛选与分析，绘制出一张综合了酵母蛋白相互作用的全局性信息图。这是以往的实验所难以获得的。

为适应功能基因网络调控研究的需要，CLONTECH公司在Merck-Washington大学的EST项目研究成果基础上，采用了与传统建库方式完全不同的细胞内同源重组方法，以高通量规模构建了一种阵列模式的酵母双杂交cDNA文库。它主要有以下特点：

（1）来源于多种组织器官和细胞系，因此含有几乎所有基因的cDNA；

（2）所含各种cDNA的丰度趋于平衡；

（3）含有较长的插入序列，但不是全长cDNA序列。

这样既避免了5’非编码区可能存在的终止密码阻碍融合蛋白的翻译，又保证了表达出的蛋白构象接近于天然。这种建库方法不仅减少了工作量，而且在双杂交中新发现的相互作用蛋白种类也明显增多。

最后，有必要指出的是，酵母双杂交技术必须与其它技术结合才能有利于对实验结果作出更为完整和准确的判断。

参考资料

1.酵母双杂交系统·钟鼎生物